DNA体外重组技术是将目的基因通过DNA连接酶连接在合适的质粒上,这种重新组合带有目的基因的质粒DNA叫做重组质粒,或重组体,重组质粒可进一步转化细菌。理论上讲,DNA重组技术很简单。当用一种限制性内切酶切割质粒DNA,然后在休外...[继续阅读]

    [1]姜泊,张亚历,周殿元.分子生物学常用实验方法[M].北京:人民军医出版社,1995:15-23.[2]StruhlK.ArapidmethodforcreatingrecomninantDNAmolcules[J].BioTechniques,1985:3:452.[3]鄂征.组织培养和分子细胞学技术[M].北京:北京出版社,1994:299-323.[4]蔡文琴,王伯沄.实...[继续阅读]

    缺口平移是一种快速、简便、成本相对较低,产生高比活性均一标记或高DNA的方法。这种方法可以用来制备序列特异的探针。当使用重组质粒探针时,虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记,但通常使用限制性内切核酸酶将插...[继续阅读]

    本方法是使用寡核苷酸引物和大肠埃希菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。本法除可替代缺口平移产生均一标记的探针外,还在许多方面优于缺口平移方法。(1)当使用[α-32P]dCTP(比活性1.11×1014Bq/mmol)时,在一个30min的反应中就可以常...[继续阅读]

    体外转录方法标记RNA探针可用商品化转录质粒来制备。这些质粒中应该包括SP6、T3或T7RNA聚合酶的RNA启动位点,而这些启动位点则与多克隆位点(multiplecloningsites,MCS)相邻。例如质粒PGEM-1、pGEM-2、pGEM-3、pGEM-4,pSP65,pSP70,pSP72等(Promega公司)提...[继续阅读]

    一、由寡脱氧核苷酸模板产生RNA探针克隆质粒pSP64、pGEM3、pGEM4等(Promega公司)含邻近于MCS的SP6(其他启动子T7或T3也可利用)RNA启动子,可作为从DNA寡核苷酸模板产生标记RNA探针的基础。所制备的寡核苷酸除了含有杂交序列外,还包括在其...[继续阅读]

    通过缺口平移方法、随机引物方法、RNA体外转录方法、接尾或激酶方法而合成的放射性标记探针在标记后必须纯化,以除去可能干扰杂交反应的未掺入标记物、酶和盐。未掺入的标记核苷酸能严重引起非特异本底信号。一般纯化标记...[继续阅读]

    基因表达的定位,基因在染色体的定位和某些特殊细胞类型中病毒序列的存在,都要通过将组织细胞固定于载玻片上,然后进行杂交分析检测,这样就可以把这些核酸顺序在原有的位置上显示出来。一般情况下为了保持组织细胞的正常形...[继续阅读]

    原位杂交组织化学技术可以检测组织细胞标本中的特异序列。在杂交和显示杂交信号以后,组织细胞可以通过光学显微镜进行检查,可以将杂交信号定位到特定细胞。这一杂交技术非常适用于形态学实验室,并且在其他相关学科也有广...[继续阅读]

    [1]PalopJJ,RobersonED,CobosI.Step-by-stepinsituhybridizationmethodforlocalizinggeneexpressionchangesinthebrain[J].MethodsMolBiol,2011,670(2):207-230.[2]PinaudR,MelloCV,VelhoTA,etal.DetectionoftwomRNAspeciesatsingle-cellresolutionbydouble-fluorescenceinsit...[继续阅读]