聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺(N,N′-methylenebisacrylamide,简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。(一)聚丙烯酰胺凝胶的合成1.凝胶总浓度...[继续阅读]

    PAGE的种类繁多,如圆盘电泳、不连续垂直板状电泳和水平平板电泳。但就其操作而言,却是大同小异。此处主要讨论不连续垂直板状凝胶电泳的操作。(一)不连续垂直板状凝胶电泳装置不连续垂直板状凝胶电泳装置通常由稳流电泳仪和...[继续阅读]

    一般单向PAGE多用于分离具有活性的生物物质,而双向或梯度PAGE则宜用于较难分离鉴定的生物大分子物质。如结合SDS以测定蛋白质亚基的分子质量;结合孔梯度进行自然蛋白质分子质量的测定;加入两性载体电解质,可分析蛋白质的等电...[继续阅读]

    由于SDS带有大量的负电荷,消除了蛋白质分子之间原有电荷的差异。所以,蛋白质的迁移率仅取决于蛋白质的分子质量的大小。与已知分子质量的标准品比较,可以测定蛋白质的分子质量。SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围,取决于用于...[继续阅读]

    SDS-PAGE操作与上述PAGE的操作大体相似,其不同之处有:1.电泳前的样品处理按表5-12的配方,配制一定量的二倍样品缓冲液,在4℃条件下可储存数月。每次使用前,样品与样品缓冲液以1:1进行混合,煮沸5min,离心,作为点样用。2.电泳溶液的配...[继续阅读]

    应用SDS-PAGE可测定蛋白质的分子质量,对蛋白质组分进行分离、分析、纯化、定性、定量以及少量的制备。相对于超离心、色谱、渗透法等,SDS-PAGE是测定蛋白质亚基分子质量的一种简单、经济、快捷的方法。(一)蛋白质组分的分离采用...[继续阅读]

    IEF的关键是在凝胶中形成稳定的、连续的线性pH梯度。根据建立的pH梯度原理的不同,可分为载体两性电解质pH梯度的IEF和固相pH梯度的IEF。前者是将载体两性电解质溶解在电泳介质溶液中制胶,形成聚丙烯酰胺或琼脂凝胶,然后将凝胶引...[继续阅读]

    1.IEF电泳凝胶的制备蒸馏水2.62mL、IEF琼脂糖0.06g和山梨醇0.76g在沸水浴中加热约20min至完全溶解,如有残留颗粒会影响电泳效果。迅速加入尿素1.9g、硫脲0.48g至全溶,轻轻搅拌均匀,然后迅速加入两性电解质(pH3.5～10)(477μL)混匀,放置数分钟...[继续阅读]

    利用IEF技术,可对蛋白质组分进行分离、分析、纯化、定性、定量以及制备,最广泛应用于测定蛋白质的等电点。如图5-13所示,用标准蛋白质的等电点(作为纵坐标)对其在IEF中移动的距离(作为横坐标)作图,即可得到标准的等电点曲线图...[继续阅读]

    IEF/SDS-PAGE双向电泳中通常第一维电泳是IEF,在细管(φ1～3mm)中加入含有两性电解质、8mol/L的尿素以及非离子型去垢剂的聚丙烯酰胺凝胶进行IEF,变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。在第二维的电泳过程中,结合SDS的蛋白质从等电...[继续阅读]