1.1.1 DNA测序原理

    DNA测序技术创建于20世纪70年代中期,主要有双脱氧链终止法(Sanger法)和化学降解法(Maxam-Gilbert法)。Sanger双脱氧链终止法又称末端终止法或酶法,由于其操作简便,易于实现自动化和规模化,故已经成为当今DNA测序的主导方法。其测序原理......查看详细>>

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1.1.2 DNA测序仪的产生与发展

    20世纪70年代,DNA测序仪的发明使序列测定与分析成为可能,DNA测序检测技术的发展大致经历了三个阶段。第一代DNA测序仪为非自动化的同位素标记(多用P32,也可用P33或S35)垂直板凝胶电泳测序仪。检测对象是φX174,cytomegalovirus(CMV)等病毒......查看详细>>

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1.1.3 其他相关技术

    伴随测序技术的进步,与其相关的PCR反应、DNA制备、文库构建等技术近年来也都向着自动化、规模化的方向发展。数据分析与处理能力是影响基因组研究进程的另一关键因素。面对呈指数增长的序列数据,需进一步开发功能强大的生物......查看详细>>

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1.2.1 工作框架图与精细图

    工作框架图可用于获得基因组的基本结构信息(如GC组成、重复序列含量等)、基因的识别和功能分类、SNP的发现等。其标准要求达到4～5倍基因组大小的原始测序数据覆盖度,拼接组装后的序列应覆盖90%以上的基因组序列,序列准确度不......查看详细>>

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1.2.2 全基因组霰弹法与逐步克隆法

    全基因组测序,尤其是大型基因组测序,通常使用全基因组随机测序策略和以物理图谱为基础的、以大插入片段克隆为单位的定向测序策略。籼稻和果蝇基因组测序采用前一种策略,而人类基因组测序采用后一种策略。两种策略的区别......查看详细>>

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1.3.1 物理图谱的制作

    物理图谱是直接检测DNA标记在染色体上实际位置的图谱。遗传图谱是根据DNA重组原理,用遗传学距离来排定含有插入片段克隆群次序的图谱,它所显示的是基因组内基因与专一的多态性DNA路标(Marker)的相对位置。而物理图谱是把这些克......查看详细>>

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1.3.2 大片段克隆文库的构建

    在逐步克隆法策略中,大片段克隆可跨越散在的重复序列,减少错拼,可提高STS筛选的阳性率,有利于克隆重叠群的拼接与组装,从而提高物理图谱的精确度。1.克隆载体的选择质粒、噬菌体、黏粒等载体的装载能力不超过50kb,因此不适用......查看详细>>

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1.3.3 大片段克隆的筛选

    通过PCR筛选出与特定STS相对应的克隆。对一个高基因组覆盖度的BAC文库进行筛选,同一个STS通常会得到多个部分重叠的阳性克隆。1.种子克隆的筛选——STS-PCR反应池方案(PoolingProtocol)首先从STS数据库中获得某一STS的特异引物序列。合......查看详细>>

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1.3.4 候选测序克隆的挑选

    为减少测序费用和工作量,通常选取图谱上自身覆盖范围大且与邻近克隆重叠较小的一组克隆,作为候选测序克隆,如图1.6所示。在测序前需对这些候选测序克隆,尤其是通过指纹图谱筛选得到的克隆的定位正确性进行鉴定。常用的鉴定......查看详细>>

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1.3.5 大片段克隆霰弹法测序

    由于目前测序技术的限制性,尚不能对大片段克隆直接进行测序。一般要先构建亚克隆文库,通过对亚克隆DNA片段进行随机测序和拼接组装,才能完成对大片段克隆的测序工作。霰弹法测序的简要流程如图1.8所示,具体步骤参看全基因组......查看详细>>

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